1,3,4Bernardi, SF; 3Vega, M; 5Mazzeo, R; 5Monti, JI; 2,3Biga, P; 2,3,4Marini, PR
1Cátedra de Obstetricia y Fisiopatología de la Reproducción y 1Cátedra de Producción Bovinos Lecheros. Fac. Cs. Veterinarias (UNR). 3Centro Latinoamericano de Estudios de Problemáticas Lecheras. 4CIC-UNR. 5Cooperativa de Inseminación Artificial de Venado Tuerto. email: [email protected]
Introducción
La motilidad de los espermatozoides es el parámetro que se utiliza generalmente para evaluar la capacidad de desplazamiento de estas células en semen de toros, siendo analizado de forma masal o individual, utilizando métodos accesibles y simples pero muy subjetivos. Esta evaluación de rutina no cuenta con la suficiente capacidad de estimar el potencial reproductivo de un toro (Morado y col., 2015; Sharma y col., 2016).
En la actualidad la movilidad cuantificada y descripta por una serie de parámetros CASA (Computer-Assisted Sperm Analysis) permite un análisis preciso, repetitivo y automático de una muestra seminal, detallando ciertas características de la trayectoria y del vigor espermático. Numerosos estudios verificaron que ciertos parámetros CASA de cinética espermática guardan relación con la fertilidad de los toros (Muiño y col., 2007; Oliveira y col., 2013; Nagy y col., 2015). Por el contrario, trabajos realizados en otras especies animales como cerdos, caballos y conejos demostraron una baja y no significativa relación entre parámetros CASA y fertilidad de estos machos (Quintero Moreno y col. 2007; Quintero Moreno y col., 2017).
La caracterización de la heterogeneidad de espermatozoides eyaculados sobre la base del análisis de sus parámetros cinéticos está ganando interés en el sector ganadero para determinar el nivel de fertilidad de un toro y de cómo responde al proceso de congelación-descongelación (Yániz y col., 2015). La identificación de la subpoblación de espermatozoides se logra mediante el agrupamiento por métodos estadísticos multivariados que permiten distinguir los espermatozoides que comparten características comunes (Martinez-Pastor y col., 2011). Se ha demostrado que la heterogeneidad de las células espermáticas muestra una alta y significativa correlación con la fertilidad en los verracos (Dorado et al., 2010), gacelas (Abaigar et al., 2001), equinos (Quintero-Moreno et al., 2004), bovinos (Hoflak y col., 2007Kanno y col., 2017; búfalos (Excel Rio y col., 2017).
El objetivo de este trabajo fue identificar las subpoblaciones espermáticas en toros Holando Argentino de buena y excelente fertilidad, como así determinar los cambios que conlleva el proceso de criopreservación y descongelación de las muestras seminales.
Materiales y métodos
Animales.
Se utilizaron 7 toros Holando Argentino de dos categorías de fertilidad: buena y excelente, por cada toro se utilizaron 3 eyaculados (uno de cada cuatrimestre del año).
Muestras de semen.
El semen fue colectado usando vagina artificial a 45ºC. Después de cada colecta y evaluación macroscópica del eyaculado, una alícuota fue analizada usando un sistema CASA (Computer Assisted Semen Analysis) para evaluar parámetros cinéticos y concentración, el resto fue utilizado para preparar dosis y se congelaron. En principio, el semen fue enfriado en cámara a 5ºC durante 4 h, luego se envasó automáticamente en pajuelas de 0,5 cc utilizando un diluyente semidefinido: Andromed, Minitub Alemania y a una concentración espermática mínima de 30 millones de espermatozoides por dosis. Las dosis fueron congeladas y almacenadas en tanques de nitrógeno líquido a -196°C y la descongelación se realizó en un baño de agua a 37ºC durante 1 minuto (se utilizaron dos pajuelas por cada eyaculado).
Evaluación de la motilidad espermática usando sistema CASA.
Se utilizó un sistema computarizado: Sperm Vision (Minitüb, Alemania), con cámara Leja de 2 µl y analizando 10 campos microscópicos en cada muestra. Los parámetros medidos fueron:
- Porcentaje de espermatozoides mótiles (MOT): porcentaje de células que tienen movimiento.
- Porcentaje de espermatozoides progresivos (PRO): porcentaje de células que siendo mótiles, describen un desplazamiento hacia delante.
- Concentración de espermatozoides progresivos por dosis ([]prog/dosis): expresada en millones.
- Velocidad curvolineal (VCL, μm/s): velocidad calculada sobre el camino real del espermatozoide entre dos puntos de su trayectoria, expresada en micrones por segundo. Describe la motilidad real de los espermatozoides.
- Velocidad lineal (VSL, μm/s): velocidad del espermatozoide sobre una línea recta entre dos puntos medida en micrones por segundo (Figura 1).
- Velocidad promedio en su trayectoria (VAP, μm/s): velocidad promedio del espermatozoide sobre el camino real del espermatozoide expresada en micrones por segundo (Figura 1).
- Linealidad (LIN, %): desviación de la velocidad del camino real a la velocidad en línea recta expresada en porcentaje. (VSL/VCL)*100).
- Rectilineidad (STR, %): desviación de la velocidad promedio a la velocidad en línea recta expresada en porcentaje. (VSL/VAP)*100).
- Amplitud lateral de la cabeza (ALH, μm): distancia promedio del desplazamiento de la cabeza desde la posición media del camino, expresada en micrones.
- Frecuencia de batido (BCF, Hz): frecuencia de corte de los movimientos laterales de la cabeza del espermatozoide, expresada en Hertz (Hz).
- Distancia en el camino promedio (DAP, μm/s ): distancia promedio expresada en micrones por segundos.
- Distancia en línea curva (DCL, μm/s): distancia recorrida calculada sobre el camino real del espermatozoide y expresada en micrones por segundo.
- Distancia en línea recta (DSL, μm/s): distancia recorrida calculada sobre la línea recta que une el punto inicial con el final de la trayectoria, expresada en micrones por segundo.
Análisis estadístico.
Los parámetros cinéticos calculados corresponden a las observaciones realizadas sobre 21 muestras de semen crudo (7 toros x 3 eyaculados) y 42 muestras de semen congelado (7 toros x 3 eyaculados x 2 dosis). Mediante un análisis de cluster y utilizando 8 parámetros como descriptores de la motilidad de los espermatozoides (VCL, VSL, VAP, LIN, STR, WOB, BCF, ALH) se agruparon las células en un número reducido de grupos definidos por su trayectoria y de modo que cada espermatozoide pertenezca a uno y sólo un grupo. Los espermatozoides que eran muy cercanos entre sí se asignaron al mismo grupo, mientras que aquellos que estaban muy separados se ubicaron en grupos diferentes. El modelo de cluster usado fue el k-means y el número específico de cluster se determinó mediante análisis previo por dendogramas jerárquicos usando el método de Ward. Por tablas de contingencia se determinó el porcentaje de espermatozoides asignado a los diferentes clusters.
RESULTADOS y DISCUSIÓN
Características cinéticas del semen fresco y descongelado
El promedio (X + DS) del porcentaje de espermatozoides (spz) mótiles (% mot) en las muestras de semen fresco fue 80,81 + 10,07 y luego de la descongelación de las dosis, dicho descendió a 54,97 + 7,28, esto muestra que el proceso de criopreservación redujo significativamente el número de células mótiles (P<0,05). El mismo comportamiento se observó al analizar el promedio de células mótiles progresivas (% mot prog), siendo de 78,46 + 10,92 y 58,59 + 7,38 para muestras frescas y luego del proceso de congelación-descongelación respectivamente (P<0,05). Al analizar los descriptores de movilidad y trayectoria de los spz se observó que el proceso de congelación-descongelación sólo arrojó diferencias significativas para VAP, WOB y BCF (Tabla 1).
Tabla 1. Parámetros cinéticos de toros Holando Argentino: semen fresco y descongelado
Características de velocidad y progresión según la categoría de fertilidad de los toros
Tanto en las muestras de semen fresco como en las analizadas luego de la descongelación, la mayor diferencia entre las categorías de fertilidad de los toros, radica en que la fertilidad excelente es superadora en la velocidad que los espermatozoides desarrollan en su trayectoria recorriendo mayor distancia, lo que implica que son más progresivos (Tabla 2).
Tabla 2. Parámetros cinéticos de semen fresco y descongelado. Toros Holando Argentino de buena y excelente fertilidad
Identificación y distribución de subpoblaciones espermáticas
Dos subpoblaciones espermáticas fueron definidas en las muestras de semen crudo y descongelado. Las características cinéticas de cada una de ellas se muestran en las Tablas 2 y 3 respectivamente. Cada grupo de espermatozoides identificado mostró diferencias significativas en patrones de movimiento y trayectoria los que se describen a continuación:
Subpoblación I (SP I): son spz con alta actividad según indican sus altos valores de velocidad (VCL, VAP, VSL); sin embargo presentan menor LIN y STR, y moderado a bajo valor de BCF acompañado de alto ALH. Al ser muy rápidos logran recorrer una distancia mayor en la misma unidad de tiempo.
Subpoblación II (SP II): está representada por spz con relativamente buena velocidad (valores medios para VCL, VSL y VAP) y buena progresión (valores medios a altos para LIN, STR, WOB, BCF y bajo ALH), no obstante la distancia que alcanzan a recorrer es relativamente menor al compararlos con los de la SP I.
En las muestras de semen crudo, el 37,5 % del total de espermatozoides se desplazan rápidamente y con bastante buena progresión, proporción que se mantiene al analizar semen descongelado (36,5%) (Subpoblación I). La subpoblación II (espermatozoides que desarrollan relativamente buena velocidad y con muy buena progresión) representa un 43,5% en el semen crudo, valor que se reduce significativamente luego del proceso de congelación-descongelación de las dosis, siendo de solo 18,5%. En las tablas 3 y 4 se muestran los parámetros cinéticos que caracterizan a cada una de las subpoblaciones espermáticas descriptas anteriormente, tanto en muestras de semen fresco como descongelado.
Tabla 3. Subpoblaciones espermáticas, semen fresco. Raza Holando Argentino
Tabla 4. Subpoblaciones espermáticas, semen descongelado. Raza Holando Argentino
Nuestros resultados coinciden con otros autores (Excel Rio y col., 2017) en el comportamiento de los espermatozoides del grupo I y II. Siendo los de la SP I los más rápidos y progresivos y por tanto recorren una distancia mayor en un tiempo determinado. Mientras que los espermatozoides de la SP II si bien desarrollan una velocidad menor lo que los lleva a que su trayectoria sea también menor, son altamente progresivos. Los parámetros VCL, ALH y BCF se consideraron medidas que reflejan el vigor de los espermatozoides, y los parámetros VSL, STR y LIN la progresividad, según la categorización realizada por Cancel et al. (2000). En base a dicha categorización nuestros resultados demuestran que las células espermáticas que forman parte de la SP I ganan en progresividad a la SP II, al tener menor LIN y STR, ambas medidas de desviación de la velocidad real o promedio de la velocidad calculada para un desplazamiento en línea recta.
El proceso de criopreservación y luego el de descongelado de las dosis disminuyó significativamente la proporción de espermatozoides mótiles, y además, esa disminución se vió reflejada sobre todo en una merma en la proporción de espermatozoides que pertenecen a la SP II.
Muiño y col. (2008) al estudiar subpoblaciones de espermatozoides con similares características de motilidad en eyaculados de toros Holstein definieron cuatro subgrupos de espermatozoides en muestras de semen fresco y descongelado. Esta diferencia en el número de subpoblaciones identificadas puede deberse a que incluyeron en el estudio toros de distinta fertilidad (mala, baja, buena y muy buena). En general, las diferencias indicaron que, en las cuatro subpoblaciones, los parámetros de velocidad del esperma (VCL, VSL y VAP) disminuyó después de la crioconservación y de su descongelamiento, comportamiento que se evidenció de manera similar en nuestro estudio. Además, la magnitud de los cambios en los parámetros cinéticos fue también bastante similar para los cuatro subgrupos de espermatozoides; coincidiendo este comportamiento con los resultados obtenidos por nosotros.
Características cinéticas de las subpoblaciones espermáticas en las distintas categorías de fertilidad
Los parámetros de velocidad y vigor de cada subpoblación se comportan del mismo modo que fue descripto para semen fresco y descongelado. Al diferenciar los toros por fertilidad se observó que cuando la fertilidad es excelente todos los parámetros que caracterizan tanto a la SP I como SP II son mejores. Es decir, los espermatozoides incluidos en las distintas subpoblaciones tienen mayor velocidad, vigor y progresión respecto de su par en toros de una fertilidad algo menor (Buena fertilidad) (Tabla 5 y 6).
Tabla 5. Subpoblaciones espermáticas en semen crudo según la fertilidad del toro
Proporción de subpoblaciones espermáticas según categoría de fertilidad de los toros
Si se compara semen fresco y descongelado, el proceso de criopreservación y posterior descongelación para el uso de la dosis seminal reduce inevitablemente el porcentaje de espermatozoides mótiles incluidos en cada una de las dos categorías de fertilidad estudiadas. Ahora, si se compara fertilidad en cada tipo de muestra seminal, la mayor diferencia al comparar toros según su fertilidad radica en la proporción de células espermáticas que representan a la SP I. En toros de fertilidad excelente, este grupo de espermatozoides siempre es mayor respecto de la encontrada para los machos considerados de buena fertilidad (Fig. 1).
Estos resultados difieren de lo reportado en un trabajo realizado en Búfalos (Excel Rio y col., 2017), donde la proporción de cada subpoblación para machos de alta fertilidad no varía al compararla con los de baja fertilidad, tanto en semen fresco como luego de descongelado.
Tabla 6. Subpoblaciones espermáticas en semen descongelado según la fertilidad del toro
Distintos grupos de investigadores propusieron en trabajos realizados con toros de razas para producción de leche, que los espermatozoides con mayores velocidades y movimiento más progresivo, se pueden considerar los espermatozoides con mayor potencial de fertilización (Quintero-Moreno y col., 2003; Cremades et al., 2005; Núñez-Martínez y col., 2006). Coincidentemente nosotros observamos que los toros de mayor fertilidad, ya sea en muestras de semen fresco como descongelado, la mayor proporción de espermatozoides corresponde a la SP I, células con alta velocidad y progresión.
Conclusiones
- Los resultados arrojados por la presente investigación indican que dos grupos de espermatozoides móviles bien definidos están presentes en muestras de semen crudo y descongelado de toros de raza Holando Argentino.
- El proceso de congelación-descongelación al que se someten las dosis para su conservación y uso posterior, modificó significativamente la distribución de los espermatozoides dentro de las subpoblaciones.
- La mayor fertilidad del toro estuvo relacionada a una mayor proporción de espermatozoides altamente veloces y de buena progresión.
- Se deben realizar más estudios para determinar la importancia relativa de las diferentes subpoblaciones de espermatozoides móviles que coexisten en muestras de semen de un toro a la hora de predecir su fertilidad.
Fig. 1. Frecuencia de distribución de los espermatozoides por subpoblaciones en toros de media y excelente fertilidad
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